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电化学发光方法监测亚细胞水平酪蛋白激酶II表达
2020-10-14 09:54:25

     蛋白激酶是催化蛋白质磷酸化过程的一种酶,其可以将三磷酸腺苷(ATP)末位(γ位)的磷酸转移到基质蛋白质的特定氨基上。激酶引起的蛋白磷酸化是细胞信号转到过程中最重要的转译后修饰机制之一,在许多基础生物学过程中发挥着重要作用。


     蛋白激酶活性的异常和异常的蛋白磷酸化状态可以导致许多疾病,如糖尿病,老年痴呆症和癌症。因此,开发蛋白质激酶的检测方法在生物学和临床领域都具有重要意义。


     监测蛋白激酶的传统方法是辐射测定法,通常依赖于在蛋白激酶存在的情况下将放射性磷酸盐(γ-32P)从 ATP 转移到特定的底物肽。γ-32P 对细胞伤害较大。目前,许多新方法已被报道用于蛋白激酶的检测。如比色法,荧光法,电化学和电化学发光法(ECL)等,其中,ECL因其简单,灵敏度高,时空分辨率高等优点,在分析化学研究越来越受到重视。


     近期,陕西师范大学化学与化工学院漆红兰教授团队在应用高敏感性ECL在亚细胞水平监测蛋白激酶上取得了进展。其研究成果“Monitoring casein kinase II at subcellular level via bio-bar-code-based electrochemiluminescence biosensing method”近期发表于分析化学领域期刊《Chinese Chemical Letters》


图1.(A)制备金超微电极,(B, C)制备用于CK2在水溶液(B)和单细胞(C)中ECL生物测定的肽修饰电极。



     酪蛋白激酶II(CK2)是人类蛋白激酶组中最具多效性的成分,因此本项研究选择其作为模型靶标。


     研究选择锆离子作为磷酸化肽和磷酸化信号探针之间的中介,无需化学激活步骤,使用金超微电极作为基电极,将磷酸化 DNA (p-DNA)和发夹 DNA (h-DNA)偶联到 AuNPs上放大信号。


     通过显微操作系统,将肽修饰金超微电极精确穿透到单细胞中,在内源性CK2和ATP存在的情况下将肽磷酸化(如图 1C 所示)。修饰电极在单细胞中磷酸化后,通过 锆离子与h-DNA/AuNPs/p-DNA 偶联。最后,[Ru(phen)3]2+插入h-DNA。在三丙胺(TPA)存在下记录 ECL信号,以此分析单细胞中的CK2水平。


图2.(A)硅烷化微管的FE-SEM图像。(B)金超微电极的FE-SEM图像。插图:超微电极上Au EDX元素图。(C)金超微电极照片。(D) 2 mmol/L甲酸二茂铁处理金超微电极CV,扫描速率10 mV/s。



图3. (A, B)多肽修饰金超微微电极插入细胞不同区域后Hela细胞明场图像(A细胞质、B细胞核)。(C) CK2在单个细胞不同区域的ECL强度。(D)6个单细胞不同区域细胞内CK2平均水平。条形图上下线代表ECL方法测量CK2的最高和最低浓度。(E)用于检测CK2的多肽修饰金超微微电极的代表性ECL强度与时间图(a)无细胞裂解液、(b)有细胞裂解液、(c) 10 umol/L CDDP刺激。(F) ECL法测定的CK2在单细胞和细胞裂解物中的浓度。ECL测量条件:0.1 mol/L PBS (pH 7.4),含50 mmol/L TPA,外加电位+0.85 V。



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