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单细胞生化分析技术在检测新冠病毒受体ACE2方面的应用
2020-03-12 10:11:11

    新冠病毒自从2019年12月开始在我国爆发以来,已经接近4个月,目前中国的疫情除局部地区外,大部分区域基本得到控制,但在世界范围还趋于上升阶段。针对此病毒,目前主要有两个方面的问题亟待解决:第一,病毒检测例检的准确性;由于样本量及检测手段的局限性,目前检测的假阴性率较高(约30-40%),漏检人数较大,增加了二次感染的风险;第二,疫苗及治疗药物的研制。该病毒目前已在世界范围传播,如果不能及时开发出有效的疫苗及治疗药物,患者死亡人数会进一步扩大,从而演变全球性传染疾病,对世界范围的经济和日常生活带来巨大的影响。而要解决以上两个问题,都需要从机理上深入研究新冠病毒侵染人体细胞的过程。

    最新研究发现,新型冠状病毒感染人体细胞的关键在于冠状病毒的S蛋白与人体ACE2 蛋白的结合。准确地说,是S蛋白劫持了原本是控制血压的ACE2,通过与它的结合入侵人体。ACE2蛋白称为血管紧张素转化酶2,它是一类跨膜糖蛋白,在肺部、心脏、肾脏等多个组织中都有表达。ACE2蛋白的特异性表达能够调节血压,维持体液平衡,参与炎症反应,促进细胞增殖,而且可能在调节心血管和肾脏功能和生育方面发挥作用。2019-nCoV引起的肺部感染,导致肺部ACE2蛋白数量减少,功能降低,从而引发急性肺衰竭。

    2020年3月4日,西湖大学周强团队Science杂志在线发表了题为Structural basis for the recognition of the SARS-CoV-2 by full-length human ACE2 的研究论文首次成功解析新型冠状病毒细胞表面受体ACE2的全长三维结构,以及新型冠状病毒表面S蛋白受体结合结构域与细胞表面受体ACE2全长蛋白复合物的三维结构(如图1周强团队的这一生物物理学研究,在理解新冠病毒如何侵染人体细胞方面取得了重要进展,最终将对研发精准的新冠肺炎诊断、治疗手段起到关键作用。(DOI:10.1126/science.abb2762



  图1:ACE2-B0AT1 复合物结构图

    目前研究ACE2的方法主要集中在样品离线成像方面;在实时检测、疫苗及药物研发方面具有局限性;因此研究能够进行实时、在线、定量检测的技术手段成为学术界和企业界的一个迫切需求。江苏瑞明生物科技有限公司经过10多年的研究,成功开发出的单细胞生化分析仪能够实时、原位、定量分析单个活细胞的酶活性、代谢物质、遗传物质及离子浓度等(如图2)。


2:单细胞生化分析仪产品图

    初步试验证明该设备能在线定量检测ACE2,具体原理及操作流程如下:


3:单细胞生化分析仪实时定量检测ACE2原理图

    利用现有的ACE2活性荧光检测试剂盒。借助单细胞分析仪设备将试剂通过空心探头注射进入单个活细胞内测试细胞活性ACE2裂解MCA肽底物释放游离荧光团MCAMCA激发波长320nm,发射波长420nm,最终通过光子计数软件利用标准物的线性关系实现实时原位量化MCA的荧光光子数



4ACE2试剂盒测试结果

    https://www.biovision.com/angiotensin-ii-converting-enzyme-ace2-activity-assay-kit-fluorometric.html


5:单细胞生化分析仪可实现单个细胞层面细胞质、细胞核内注射

优点:

1.样本需求少,只需要单个细胞。检测时间短。

2.试剂盒耗材使用少,经济节约。每次用量约10fl。

意义:

 S蛋白与其受体的相互作用,是病毒传播的重要决定因素之一。可根据检测到的ACE2酶活性,达到如下两个目的:

1. 检测细胞是否感染?从而进一步判断患者是否被感染,起到准确检测的作用;

2. 作为药物疗效监测指标。在疫苗及药物研发过程中,可以将药物与感染细胞共培养,然后通过检测ACE2酶活性的高低来判断药物疗效(酶活性与药物疗效成正比)。

本技术在可深入理解病毒入侵细胞的机制,有助于我们进一步理解病毒跨物种及物种间的传播,为早期的检测及预防工作提供了重要方向,为后期的疫苗及药物研制提供了基础性关键信息和一种新颖的方法。



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