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单细胞分析技术在转化医学领域的应用
2017-02-21 09:41:02
细胞具有天然的异质性
  异质性是细胞的天然特性之一,看似相同的一群细胞,其内部有可能存在本质的差别。这种异质性是由很多因素造成的,除了各细胞所处微环境的差异以外,更多的是细胞内在活动的一种表现;通常,细胞的异质性主要体现在以下几个方面:
  在基因水平,基因组本身就存在多态性,各种突变、重组会引起不同细胞间基因组序列上的差异;此外,甲基化、乙酰化等表观遗传修饰上的差异也会引起细胞间基因表达上的不同;在转录水平,不同的细胞内转录调节蛋白的种类和活性各不相同,许多基因的转录还具有一定的随机性。在蛋白水平上,不同细胞内各个蛋白表达量和修饰状态各不相同,各个信号通路状态也有所不同,而这也会反过来影响基因的转录。
  这些差异反映在细胞水平上就表现为细胞功能的异质性。在基础和临床医学研究中,这种异质性是无法忽视的。一个典型的例子就是免疫系统B、T细胞成熟过程中的所表现出的异质性,这种异质性是免疫系统应对复杂的机体内外环境的基础;另外,在癌症发生过程中,由于基因突变等事件具有一定的偶然性,癌症组织也具有非常大的异质性,这种异质性也常常会成为临床上癌症治疗的主要障碍之一。
  单细胞分析是研究细胞异质性的有效手段
  研究细胞异质性的关键就在于能否实现对单个细胞进行较多参数的分析,这就是“单细胞分析(single cell analysis)”的概念。事实上,自从“细胞”学说被提出后,人类一直在努力寻求分析单个细胞的技术方法。但是,单细胞分析有一个巨大的挑战,那就是样品量及其有限,一个典型的人类细胞仅含有约6.6pg DNA、10pg总RNA。从如此有限的样品中获取大量精确的数据无疑是一个巨大的挑战。 所以,传统的高通量分析手段例如基因组学、转录组、蛋白质组学等,往往只能基于大量细胞进行分析,得到的也是大量细胞的平均信息;而一些可以针对单细胞进行分析的方法,例如免疫荧光、流式细胞术等,也会受到通道的限制,仅仅对少数几种蛋白进行分析,同样无法深入分析其异质性。
  直到近几年,随着相关领域的一系列技术突破,“单细胞分析”的概念才真正得以实现。两类技术在这过程中起到了先导作用,首先是测序技术的进步,以illumina为代表的第二代测序技术大大降低了测序成本,使在一个实验中对多个样本测序成为可能;其次,一些可以用于单细胞核酸样本的扩增技术(例如MDA扩增基因组,SMART、TargetAmp可以扩增转录组)的开发,解决了单细胞核酸样品量少的问题。这两类技术的结合,实现了对单细胞基因组和转录组的测序,开创了组学的重要分支:单细胞基因组学(single cell genomics)和单细胞转录组学(single cell transcriptomics)。后来,随着基于微流体芯片技术的C1单细胞全自动实验系统和Biomark HD(Fluidigm)的广泛应用,单细胞分析开始向自动化、更多细胞通量的方向发展。
  与此同时,新的单细胞蛋白质检测技术也不断涌现。其中,比较有代表性的就是质谱流式技术(Mass Cytometry),通过特殊的金属标签抗体,它可以实现在单个细胞上几十个蛋白的同时检测。
  单细胞分析技术促进了转化医学的发展
  转化医学是近年来在医学健康领域出现的新概念,目的是为了缩短基础与临床之间的距离,促进基础研究和临床研究成果的相互转化。多参数单细胞分析在转化医学的研究中有着独特的优势,这是由于临床样本具有其特殊性决定的。
  首先,临床样本也存在很大的异质性,只有单细胞分析才能有效揭示这种异质性;第二,很多临床样本量及其有限,极端情况下甚至只有一个细胞可供检测,单细胞检测是唯一可行的方法;第三,临床样本都是来自人的样本,和实验动物不同,对于人所能用的研究方法受到很大限制,因此要求我们在有限的样本中尽量多的获取数据。而多参数单细胞分析恰恰满足了这种需要。
  目前,单细胞检测已经在转化医学领域有了广泛的应用,突出表现在以下一些方面:
  1)疾病早期诊断
  用于疾病早期诊断或者预后相关标志物的寻找,有效的指导临床;甚至在一些案例中,单细胞分析技术可以直接做为早期诊断手段使用。
  2014年年中,斯坦福大学利用质谱流式技术对髋关节置换病人手术前后的免疫细胞进行分析。经过一系列细胞亚群和信号通路分析,研究者发现了病人单核细胞中的NK-b等数个信号通路分子激活与病人康复速度有很高的相关性。基于此,研究人员可以开发一套基于外周血的康复时间预测方法。
  着床前胚胎遗传学诊断(Preimplantation genetic diagnosis 简称PGD)是避免有遗传病史的父母生出遗传缺陷婴儿的重要手段。美国生殖医学中心完成了全球第一例胚胎单细胞测序。数据表明,这种胚胎单细胞基因检测技术可以使体外受精获得健康胚胎的成功率提高到99%,避免婴儿出现唐氏综合症以及其他染色体异常等遗传疾病。
  2)疾病发生机制研究
  多参数单细胞分析可以帮助研究人员深入分析正常或者病变组织的精细构成,了解其在生理或病理进程,发现组织中发挥重要作用的细胞亚群。这对于研究相关疾病的发病机制具有非常重要的意义。
  例如,德州大学MD Anderson癌症研究中心对乳腺癌进行了单细胞测序分析,通过对乳腺癌样本中不同单细胞基因组的比较研究,发现乳腺癌发生过程中不同突变的出现的阶段性;斯坦福大学Bendall等利用质谱流式技术对正常人骨髓样本中的不同分化阶段的B系细胞进行检测分析,不但精细展示了B细胞发育成熟的过程,而且新发现了B细胞发育过程中的一个重要Checkpoint。
  3)药物作用机理研究
  人体组织细胞具有复杂的异质性,不同细胞对于同一药物的反应也具有差异。以往对药物作用机制的研究主要是基于一些相关的细胞株或者细胞系,但是这并不能全面反映人体组织对于药物的反应。事实上,正是一些药物对“非靶细胞”的作用,导致了药物副作用的产生。单细胞分析可以研究这种异质性,它可以帮助我们了解组织中不同细胞对药物的反应。
  斯坦福大学的Nolan 实验室曾经用Dasatinib(一种用于治疗白血病的药物)处理正常人骨髓样本,利用质谱流式进行检测,经过细致的亚群和信号通路分析,观察到了骨髓内30多个不同亚群在药物刺激时18个信号通路激活水平的改变。
  最近,第16届基因组生物学进展年会上(AGBT)推出Polaris单细胞实验系统,全面集成了单细胞的分选、捕获、培养、给药以及核酸样品制备,为药物机制研究增添了又一有力工具。
  4)为实现个体化治疗提供数据支持
  临床样本的异质性不但体现在样品内细胞的不均一,也体现在样品之间的差异。单细胞分析也可以非常方便的对不同病人样本进行比较,找出不同样本中具体的差别。这些数据可以成为制定个体化治疗方案的重要依据。
  目前,研究最多的就是各种类型的癌症样本的分析,先后有多个研究小组利用质谱流式技术对白血病、乳腺癌、卵巢癌等进行多参数检测和分析,这些数据可以全面地反映病人样本间的差异。随着该领域研究的逐步深入,个体化治疗方案的制定将会有一个坚实的数据基础。
  结语:

  单细胞分析已经渐渐渗透转化医学的诸多相关领域,随着相关技术的不断进步和普及,它将继续推动基础研究和临床研究协同发展。从某种意义上说,在未来人类的健康将很大程度上取决与我们对于自身细胞的了解程度,因为,细胞是构成生命基本单元,一切问题的根本都将归结于细胞本身。

转自转化医学网

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